細(xì)胞免疫熒光簡單實(shí)驗(yàn)步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小時。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘。3. PBS洗凈：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。5. PBS洗凈：2×5 min。6. 羊血清封閉：37度，20分鐘。7. 一抗，4度過夜，一般要大于18小時或者37度，1-2小時。8. 4度PBS洗凈，3 min×5次。9. 二抗37度小于一小時。10. 37度 PBS洗凈，3×5 min。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）；不管采用何種方法，在使用PBS緩沖液漂洗時，都要漂洗干凈并且要測下pH值，可以使用PBS多清洗幾次，也可以延長PBS清洗時間，如果結(jié)果背景較高可以延長漂洗的次數(shù)和時。免疫熒光技術(shù)可以用于研究免疫相關(guān)疾病和自身免疫病。CD19免疫組化IHC

直接免疫熒光：單抗體（一抗）用于免疫染色和檢測目標(biāo)蛋白。熒光素結(jié)合的一抗直接與目標(biāo)抗原結(jié)合，并使用成像顯微鏡觀察。直接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn)：由于無需為兩種抗體選擇不同的物種反應(yīng)性，從而降低了物種交叉反應(yīng)性問題。與間接免疫熒光相比，時間縮短（操作步驟減少）。直接免疫熒光的缺點(diǎn)：不允許通過二抗進(jìn)行信號放大；檢測靈敏度降低；熒光素結(jié)合一抗的選擇有限；與使用熒光二抗的檢測相比，更昂貴。間接免疫熒光：使用兩種抗體（一抗和二抗）進(jìn)行免疫染色并檢測目標(biāo)蛋白。首先，用特異性一抗標(biāo)記目標(biāo)蛋白。然后，熒光素結(jié)合的二抗（與一抗具有不同的物種反應(yīng)性）識別結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物并與一抗結(jié)合。由于一個以上的二抗可以與一抗結(jié)合，熒光信號被放大，提供了更高的檢測靈敏度。N-cad免疫檢測免疫熒光技術(shù)具有高靈敏度和高特異性，可以檢測非常低濃度的目標(biāo)分子。

免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種．它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記抗體獲得成功。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，該技術(shù)已相當(dāng)成熟。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)。在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所以人們習(xí)慣將熒光抗體技術(shù)稱為免疫熒光技術(shù)

細(xì)胞免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)是利用免疫技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，原理就是利用抗原-抗體反應(yīng)之后，采用熒光標(biāo)記，標(biāo)記完成后，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)某種抗原成分的多少，從而做出一個定位研究，也可以為細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)提供一個明確的指導(dǎo)，細(xì)胞免疫熒光具有敏感性強(qiáng)、特異性高、速度快的特點(diǎn)，是目前比較常用的組織學(xué)技術(shù)，也是比較精確的。免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合來顯示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗結(jié)合，其次是帶有熒光基團(tuán)的二抗識別并結(jié)合一抗，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光。熒光抗體技術(shù)具有高靈敏度和高特異性，可以實(shí)現(xiàn)精確的免疫檢測。

熒光的猝滅：熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱甚至猝滅，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài)，所吸收的能量無法以熒光的形式發(fā)射。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑，以消除不需用的熒光。因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。在熒光抗體技術(shù)中常用一些非熒的色素物質(zhì)如亞甲藍(lán)、堿性復(fù)紅。伊文思藍(lán)或低濃度的過錳酸鉀、碘溶液等對標(biāo)本進(jìn)行得當(dāng)復(fù)染，以減弱非特異性熒光本質(zhì)，使特異熒光更突出顯示。免疫熒光技術(shù)可以用于研究心血管系統(tǒng)的疾病和醫(yī)治。CRT(Calreticulin)免疫熒光IF

免疫熒光技術(shù)可以同時檢測多個目標(biāo)分子，通過不同顏色的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記。CD19免疫組化IHC

免疫熒光通透（目的是使抗體進(jìn)入胞內(nèi)），0.5%TritonX-100(一種去垢劑，用PBS配制)室溫通透20min（針對胞內(nèi)抗原，若是細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原則省略該步驟）；除了TritonX-100，也可作為通透劑，并且固定后的樣品不需要通透。封閉（減少一抗和二抗與非特異位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合），通透后用PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室溫封閉30min。常用的封閉液包括：與二抗同一來源的血清、BSA或者是羊血清。從封閉開始所有的步驟，一定要注意樣品的保濕，避免樣品的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。醛類固定的樣品，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封閉液進(jìn)行封閉。CD19免疫組化IHC

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